本发明提供了一种多物种未出现k?mer子序列计算和特征分析方法及系统，该方法包括：获取原始的物种全基因组数据，并对物种全基因组数据进行数据预处理，获得全基因组序列预处理数据；基于所述物种全基因组序列预处理数据进行不同k值长度下的未出现k?mer子序列的计算；对不同的多个物种的全基因组数据，进行多物种之间，相同k值长度下共同未出现k?mer子序列的计算；基于未出现k?mer子序列的数据结果，进行长度变量分析、GC含量和AG含量的比例统计分析和差异显著性分析、进行Motif发现。该方法能够有效处理多物种全基因组数据，准确计算出未出现k?mer子序列，并且做有效分析，且有大大提高计算效率。