本发明属于核酸分子单碱基错配的识别领域，公开了一种单分子水平同时区分单个碱基错配的方法。单分子水平同时区分单个碱基错配的方法包括：结合纳米孔电化学技术确定非标记的共臂型改良分子信标；依据分子信标引起的单个目标分子穿孔行为的特征阻断时间，发展单分子策略同时区分完全互补和单碱基错配的序列。本发明结合纳米孔电化学技术，设计了一种非标记的共臂型改良分子信标，其在识别靶序列时表现出较高的信背比(～104)，较高的热力学稳定性以及较快的杂化速率。这种免标记的单分子策略实现了在单分子水平同时区分完全互补和单碱基错配的序列，本发明在快速检测、精准识别、以及早期临床诊断等领域具有潜在的应用价值。