本发明提供了一种蛋白酶对弹性蛋白纤维催化水解活力的测定方法及其应用，包括以下步骤：（1）弹性蛋白粉底物的制备：以动物皮、韧带等富含弹性蛋白的动物组织为原料，经过脱脂、脱水、干燥、粉碎、过筛等工序获得富含弹性蛋白的弹性蛋白粉；（2）铬鞣弹性蛋白粉的制备：将制取的弹性蛋白粉与铬鞣剂进行铬鞣，使铬鞣剂与弹性纤维充分结合，随后过滤、洗涤、脱水、干燥、粉碎即得；（3）制备待测反应液和空白对照液；（4）消解液中的锁链素浓度测定及酶活力计算。该方法适用于在皮革领域中表征蛋白酶对弹性纤维或铬鞣弹性纤维的水解活力及蛋白酶对生皮和蓝湿革作用性能的评价。