本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种基因打靶用中间载体及其制备方法和用途。基因打靶用中间载体含有两个loxp位点序列和两端各连接一个frt位点序列的阳性筛选基因。本发明从构建打靶载体的根本出发，在以往实验方法的基础上，首次开发出了一种能用于基因敲除打靶载体构建的中间载体。由于该载体具有普遍、通用的使用价值，可以运用到现阶段几乎所有类型的基因敲除打靶载体构建系统，而且简化构建打靶载体的实验路线，易化实验的操作，减少试验出错的几率；节约时间，降低成本，相对于现有技术都有很明显的优点，使用范围广，具有很好的应用市场前景。