本发明公开了一种利用CRISPRCas9技术敲除大肠杆菌中多粘菌素耐药基因mcr‑1的方法，包括以下步骤：设计如合成sgRNA的两条引物序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，退火形成双链sgRNA序列，与psgRNA‑GFP质粒进行连接，构建psgRNA‑GFPmcr‑1重组质粒，采用电转化法将CRISPR/Cas9敲除系统转化至携带mcr‑1的大肠杆菌中，敲除mcr‑1基因。本发明具有操作简便、mcr‑1基因敲除成功率高等优点。