本发明提供了一步法荧光检测体系及凝血酶检测方法，涉及分析化学技术领域。本发明所述检测体系中包括B‑H2功能化纳米纤维膜，支撑DNA，输出DNA，竞争DNA，缓冲溶液，硫黄素T(ThT)，H1序列和凝血酶，将所述检测体系用于检测凝血酶时，基于纳米纤维膜表界面上反应热力学和动力学的提高，相应的检测体系具有1.0pM的检出限，且在50pM～5nM之间具有良好的线性关系，优异的选择性以及长期稳定性。本发明利用所述检测体系进行测样时，通过整合PiDSD过程，CHA放大以及ThT结合反应，避免了ELISA要求的分离和洗脱过程，节约时间，简化步骤。