本发明涉及一种绵羊李斯特菌平衡致死系统、构建方法及应用，在actA和plcB双基因减毒LI菌株的基础上，利用同源重组的方法得到缺失四个基因(actA、plcB、dal、dat)的减毒营养缺失株(LI△actAplcB△dal△dat)，该减毒营养缺失株在不添加D‑丙氨酸的营养环境中不能生长，再构建dal基因回补质粒导入此菌株，则获得了LI平衡致死系统，即回补菌(LI△actAplcB△dal△dat:dal)。本发明获得的LI平衡致死系统遗传稳定。本发明获得的LI平衡致死系统的细菌胞内含有的回补质粒，可作为插入外源抗原基因的载体，使该系统能稳定携带、表达外源基因，再利用LI本身具有的与抗原递呈相关的生物学特性，即可作为一种制备疫苗的载体加以应用。