本发明提供了一种检测亚硫酸盐的生物发光探针及其制备方法和用途，该探针是如式I所示的化合物，或其盐，或其立体异构体。其中，n为1～5的整数；R1、R2、R3、R4、R5、R6分别独立选自氢、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、卤素、羟基、羧基、氨基、硝基。本发明生物发光探针对亚硫酸盐中的亚硫酸根离子具有高选择性和高响应性，能够单一准确的选择亚硫酸盐，检测时灵敏度很高，可检测出浓度很低的亚硫酸盐，用于亚硫酸盐的精密检测。同时，本发明生物发光探针还能在活体水平对外源性亚硫酸盐和亚硫酸盐氧化酶缺乏症引起的亚硫酸盐蓄积进行动态可视化分析，有利于临床上对亚硫酸盐的检测，具有广阔的应用前景。