本发明公开了一种人类睾丸组织悬液冷冻保护剂及其制备方法，人类睾丸组织悬液冷冻保护剂包括以下原料：氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、HEPES、咖啡因、丙酮酸钠、己酮可可碱、甘氨酸、葡萄糖和蔗糖；人类睾丸组织悬液冷冻保护剂还包括乳酸钠和甘油。本发明还包括上述人类睾丸组织悬液冷冻保护剂的制备方法和采用上述人类睾丸组织悬液冷冻保护剂的冷冻方法。本发明针对睾丸组织悬液专门设计了冷冻保护剂，能够提升睾丸精子冷冻复苏效果，有效解决了存在安全隐患、冷冻复苏效果不佳和不易找到活动睾丸精子等问题，具有十分重要的临床应用价值。