本发明提供了一种简便的细菌体内线性化载体自重组的质粒构建方法，包括如下步骤：1)合成带有目的片段的引物对；2)应用上述引物，以质粒空载体为模板进行PCR扩增；3)PCR产物纯化回收，得到含目的片段的线性化载体；4)转化，线性化载体在细菌体内重组获得质粒。其中步骤1)所述引物每条含有2部分：第1部分是能与质粒载体互补的序列，位于引物3′端，第2部分是含目的片段的组合片段，位于引物5′端；所述引物对中两条引物的“第2部分”包含10‑15bp的反向互补序列。本发明步骤精简、耗时少，具有良好的应用前景。