本发明提供了一种结核分枝杆菌检测引物和探针组合物，所述结核分枝杆菌检测引物和探针组合物至少包括核苷酸序列如SEQ ID ****和SEQ ID NO.2所示的第一引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的第二引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的探针，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的内对照引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的探针。本发明的引物和探针组合物能够保证结核分枝杆菌检测的高灵敏性和特异性，能够检测到低3copies/反应的阳性，避免了荧光定量可能出现的假阴性问题。