本发明属于基因启动子技术领域，公开了一种增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子、筛选方法及应用，启动子PEMS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子的筛选方法包括：构建合成启动子调控报告基因表达的重组质粒；启动子活性的体外初步筛选；含报告基因的质粒的构建；启动子活性研究实验。本发明提供的增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子PEMS，在体内、体外实验中的表达效率显著高于CMV启动子，在骨骼肌中启动基因表达的强度、特异性及持续时间方面表现优秀，在后续的基因治疗领域具有很大的潜能，可通过肌肉注射在实验动物乃至人体实现生物学功能或进行基因治疗。