本发明属于生物技术领域，公开了一种粪污噬菌体DNA的提取方法，该方法采用超滤浓缩法和硅胶吸附柱法相结合，即首先采用超滤浓缩器浓缩纯化噬菌体，然后再采用硅胶吸附柱法提取噬菌体DNA。本发明还公开了利用前述粪污噬菌体DNA的提取方法提取粪污噬菌体DNA的试剂盒及该试剂盒的应用。本发明的优点在于，通过对现有技术的改进，结合100?kDa超滤浓缩器和硅胶吸附柱可以在5h内获得浓度约为53.47ng/μL的粪污噬菌体DNA，本发明提供的粪污噬菌体DNA的提取方法不仅缩短了提取时间，且提取的DNA浓度和纯度较好，满足后期qPCR和宏基因组测序要求。