本发明提供了一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价和活力测定方法及其应用，包括以下步骤：（1）铬鞣皮粉底物的制备：加入一定量的铬鞣剂对皮粉进行鞣制，再经充分洗涤、干燥、粉碎、过20‑200目筛；（2）制备待测反应液：向50‑200 mg铬鞣皮粉中加入1‑20 mL缓冲液，混匀，加热至测定温度，加入蛋白酶溶液0.1‑5.0mL，在测定温度下振荡反应，反应结束后离心，取上清液进行消解，消解液经稀释后即为待测反应液；（3）消解液中的羟脯氨酸浓度测定及酶活力计算。该方法适用于在皮革领域中表征蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的水解活力及蛋白酶对蓝湿革作用性能的评价。