本发明提供了一种糖蛋白完整O‑糖肽定量分析方法，包括以下步骤：(1)糖蛋白加热变性后，进行还原烷基化处理，打开糖蛋白的二硫键并烷基化封闭；(2)N‑糖链去除：在超滤管中使用PNGase F蛋白酶切除糖肽上的N‑糖链，离心去除N‑糖链；(3)获得肽段：在超滤管中使用胰蛋白酶将蛋白质酶切成肽段，离心即得肽段；(4)亲水作用色谱纯化：HILIC填料结合肽段，洗涤除杂，再洗脱得O‑糖肽；(5)使用LC‑MS/MS分析完整O‑糖肽；(6)使用Xcalibur定性定量分析完整O‑糖肽。本发明能简单、有效地实现糖肽相对定量，具有良好的应用前景。