本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种构建同一基因不同表达载体的分子克隆方法。针对目前无法实现快速构建同一基因不同表达载体的问题，本发明提供一种高通量构建同一基因不同表达载体的快速分子克隆方法，包括以下步骤：a、设计合成载体改造引物MF和MR；b、设计合成目的基因引物IF和IR，载体扩增引物VF和VR；c、进行PCR，分别获得线性目的基因和线性目的载体DNA；d、将两次PCR产物混合放置，使线性目的基因和线性目的载体DNA自发连接成环状，得到含有目的基因的载体。本发明对载体进行统一改造，使不同用途的表达载体具备统一的DNA序列，从而实现高通量构建同一基因的不同表达载体，简便、高效、经济，具有广阔的应用前景。